2022, Vol. 62中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 姚宁, 鲁重, 王菲, 钟孝俊, 杨梦华. 2022
- YAO Ning, LU Zhong, WANG Fei, ZHONG Xiaojun, YANG Menghua.
- 双组分系统EnvZ/OmpR促进副溶血弧菌抵抗碱胁迫的作用机制
- The two-component system EnvZ/OmpR mediates alkaline stress tolerance of Vibrio parahaemolyticus
- 微生物学报, 62(12): 5043-5055
- Acta Microbiologica Sinica, 62(12): 5043-5055
-
文章历史
- 收稿日期：2022-04-07
- 修回日期：2022-05-07
- 网络出版日期：2022-06-20
引用本文 |
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)属于革兰氏阴性嗜盐菌，其广泛分布于海洋和河口环境中，可感染多种水生动物，造成虾、蟹大量死亡，给水产养殖业带来巨大经济损失[1]。人类若食用感染副溶血弧菌未煮熟的海产品，容易出现急性胃肠炎，引起腹泻、恶心、呕吐、头痛、发热等症状[1–2]。近年来，由于经济和物流运输的快速发展，各类海产品被销往全国各地，副溶血弧菌及其引发的流行病正在全国范围内呈现扩张态势[3–5]。
副溶血弧菌具有较强环境适应力，可在盐浓度较高环境中生存与繁殖，并且可抵抗碱胁迫[6–7]。从有氧和碱性的海水生态系统进入宿主肠道内，副溶血弧菌需要不断地调整基因表达，以适应外部环境的变化[1–2]。在此过程中，双组分系统(two-component system，TCS)发挥了重要作用。TCS主要包含2种蛋白，即组氨酸激酶(histidine kinase，HK)和响应调节蛋白(response regulator，RR)[8]。在典型的TCS结构中，HK作为一种感受器而存在，RR则作为一种效应器而发挥功能。TCS的信号传导基于HK与RR之间的磷酸基团转移，即磷酸基团从HK保守的组氨酸上转移到同源RR保守的天冬氨酸上，由此调节细菌的一系列生理功能[8–9]。
目前，有关副溶血弧菌适应高渗透压和碱性环境的作用机制尚不清楚。EnvZ/OmpR由位于细胞膜上的HK蛋白EnvZ和细胞质中的RR蛋白OmpR所构成，已有研究报道双组分系统EnvZ/OmpR可调节细菌对渗透压的适应性[10–12]。该TCS最初在大肠杆菌中参与调节孔道蛋白表达，从而促进细菌适应外界渗透压的变化[13–14]。随后，EnvZ/OmpR在多种细菌中被发现作为渗透压调节器而发挥功能[10,15–17]。此外，在霍乱弧菌中，OmpR蛋白被鉴定可抑制转录调控因子AphB的表达，调节细菌对碱性环境的适应力[12]。因此，EnvZ/OmpR在调节细菌适应渗透压和碱胁迫中发挥了重要功能，但是该TCS在副溶血弧菌中的功能尚未被研究报道。
本文从鉴定副溶血弧菌中的EnvZ/OmpR出发，研究该TCS对副溶血弧菌适应外部应激环境的影响，并重点研究了OmpR对该菌抵抗碱胁迫的作用机制。本研究可为阐明副溶血弧菌适应碱性环境的分子机制提供理论依据，为进一步研究副溶血弧菌的防治策略提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料副溶血弧菌菌株RMID 2210633(链霉素抗性)，质粒pDS132 (氯霉素抗性)、pBAD24-Cm (氯霉素抗性)、pBAD24-Amp (氨苄青霉素抗性)、pBBR-lux (氯霉素抗性)，大肠杆菌DH5α-λpir感受态细胞均为实验室自备；MLB液体培养基：3% NaCl [生工生物工程(上海)股份有限公司]、1%胰蛋白胨(北京拜尔迪生物技术有限公司)、0.5%酵母提取物(北京拜尔迪生物技术有限公司)；LB液体培养基：1% NaCl、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物；蔗糖[生工生物工程(上海)股份有限公司]；7300型实时荧光定量PCR仪(ABI)；pH计(Sartorius PB-10)；PCR仪(Eppendorf)；移液枪(Eppendorf)；核酸电泳仪(北京六一仪器)；高压灭菌锅(厦门致微仪器有限公司)；多功能酶标仪(Bio-Tek)；小型台式高速离心机Centrifuge 5418 (Eppendorf)；恒温振荡培养箱(太仓市科教仪器厂)；PCR产物纯化/胶回收试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)；荧光定量试剂盒(TaKaRa)；质粒提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)；反转录试剂盒(TaKaRa)；限制性核酸内切酶(NEB)；RNAiso Plus (TaKaRa)；阿拉伯糖[生工生物工程(上海)股份有限公司]。
1.2 蛋白结构域预测及序列比对根据NCBI数据库中副溶血弧菌菌株RMID 2210633的基因组(GenBank: BA000031.2)信息，获得VP0154和VP0155的蛋白序列，利用SMART在线工具(https://smart.embl.de/)对以上蛋白进行结构域分析。此外，利用NCBI数据库中BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，对不同种类的蛋白进行同源性分析。若2种蛋白序列的同源性大于30%且具有相似的结构域，则认为两者具有同源性。
1.3 副溶血弧菌缺失株和回补株的构建以ompR (vp0154)缺失株构建为例，利用副溶血弧菌RIMD 2210633菌株基因组序列为模板，使用clone manager软件设计用于构建ompR基因缺失株的各对引物(P1–P4)。以副溶血弧菌全基因组为模板进行PCR，扩增ompR基因上下游同源臂。其中上游同源臂由引物P1和P2扩增所得，下游同源臂由引物P3和P4扩增所得。利用引物P1和P4对上下游同源臂进行融合PCR，得到ompR缺失的DNA片段。利用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ对该片段和pDS132空质粒酶切过夜，利用T4 DNA连接酶进行酶连。随后，将重组质粒电转至DH5α-λpir感受态细胞中，并涂布至含氯霉素抗性(0.02 mg/mL)的LB平板上。挑取该平板上的菌落进行PCR验证，得到阳性菌株命名为pDS132-ompR，并送至杭州有康生物科技有限公司进行测序验证。本研究利用三亲接合的方式进行基因同源重组[18]，即将含重组质粒的阳性菌株、辅助菌pRK2013-HB101以及副溶血弧菌野生株，在LB或MLB液体培养基中培养过夜；随后，4 500 r/min离心5 min收集菌体，将3种菌体混合，并在无抗LB固体培养基上接合6 h；收集菌落，涂布到含链霉素(0.10 mg/mL)和氯霉素(0.02 mg/mL)双抗的MLB固体培养基上，将单菌落依次在含有该双抗MLB平板、含0.10 mg/mL链霉素MLB平板以及含有20%蔗糖LB平板上划线传代，以筛选副溶血弧菌的ompR缺失株ΔompR。以ompR回补株构建为例，利用同样的方法获得构建回补株的引物(CΔvp0154-Rev和CΔvp0154-Fwd)、ompR回补片段以及相应的重组质粒pBAD24-ompR。同样以三亲接合的方法，获得回补株CΔompR。各缺失株构建引物见表1，各回补株构建引物见表2。
| Primers | Sequences (5′→3′) |
| vp0154-P1-Xba Ⅰ | GCTCTAGAACAACAAGCAAAGCGCAGAATCTTAACTTC |
| vp0154-P2 | GTATTCACGACCGTGAAAGTTTTCGCGTGT |
| vp0154-P3 | GAAAACTTTCACGGTCGTGAATACTCTGCG |
| vp0154-P4-Sac Ⅰ | CGAGCTCCCCTTTCGACATCTGGTTAAATGCACGAGT |
| vp0155-P1-Sac Ⅰ | CGAGCTCGAGCAAGGTTTTCAAGTCCGTAGTGTAGCA |
| vp0155-P2 | ATCACCACGGGTATTCAGTTCGTGAGCAAG |
| vp0155-P3 | CACGAACTGAATACCCGTGGTGATACGGCG |
| vp0155-P4-Xba Ⅰ | GCTCTAGAGGGAAACCAACCTCGTTGCGCTACCGATTC |
| vp2184-P1-Sac Ⅰ | CGAGCTCCCGTCATCTACGCGAAACCACTGGCTTGAA |
| vp2184-P2 | TTCGATGTATTCACGGTTCAATAGTCGAAG |
| vp2184-P3 | CTATTGAACCGTGAATACATCGAAAGTGGTGAA |
| vp2184-P4-Sph Ⅰ | ACATGCATGCAAGCTGGGTGAGCGAATTCGTGAAGATTAC |
| vp0493-P1-Pst Ⅰ | AAAACTGCAGATGTAACTGTTATTAATCGTTTAAG |
| vp0493-P2 | TGGCTTTTTCTGTTTGAGGTAGGTTTAGGTTT |
| vp0493-P3 | ACCTACCTCAAACAGAAAAAGCCATTTTTTC |
| vp0493-P4-Sac Ⅰ | CGAGCTCATGCGAGCATTGACGTTGTTTGGACACAT |
| vp1218-P1-Xba Ⅰ | GCTCTAGATTTTAAGTGGCTACCCATCAA |
| vp1218-P2 | CAAGCGCACGCCGACGTTTTGCAAAGCTAT |
| vp1218-P3 | TTGCAAAACGTCGGCGTGCGCTTGCACAGC |
| vp1218-P4-Sac Ⅰ | CGAGCTCGTCATCTTCACCGTCAGTTCG |
| vpa0085-P1-Sac Ⅰ | CGAGCTCGAACCACGCTGGCATAAACCA |
| vpa0085-P2 | CGACACGGAAGAGTGCAGAAGTAAGGTATC |
| vpa0085-P3 | TTCTGCACTCTTCCGTGTCGGTTTGAAATA |
| vpa0085-P4-Sac Ⅰ | GCTCTAGAAAATTCGCCCGAGTAGTTGGC |
| vpa1745-P1-Xba Ⅰ | GCTCTAGACTGTATCAAGCGGAAGATGGG |
| vpa1745-P2 | AAACTCGAATCTGTATCGTGCTTACAGCTC |
| vpa1745-P3 | TAAGCACGATACAGATTCGAGTTTAGCCAG |
| vpa1745-P4-Xba Ⅰ | GCTCTAGAGGGTCACCCAACAAGTAGCGT |
| vpa1308-P1-Xba Ⅰ | GCTCTAGATTCTTTGTCTTGGTTTTCTGC |
| vpa1308-P2 | CAATTGGGCACAAATTGGTGTCGTTTTGGA |
| vpa1308-P3 | CACCAATTTGTGCCCAATTGAAGTAATATC |
| vpa1308-P4-Sac Ⅰ | CGAGCTCCTATGTGGAGAAACAAATTGA |
| Primer | Sequences (5′→3′) |
| CΔvp0154-Rev | CCCAAGCTTTTACGACTCTTTGCCGTCTGGGACAAATAC |
| CΔvp0154-Fwd | CGGGGTACCGTCAATAGATGCTTCTGAAAGGATGTTTCA |
| CΔvp0155-Rev | CCCAAGCTTTTATTTGGTCGGGAAACTGATTTG |
| CΔvp0155-Fwd | CGGGGTACCAGGATCATTAGGAAATTTCCATGCG |
1.4 生长曲线测定
将野生型菌株和缺失株转接到含链霉素(0.1 mg/mL)的MLB培养基中，37 °C振荡过夜培养，第2天按体积比1:100转接到含有链霉素的MLB液体培养基中，再吸取200 μL混合液至96孔细胞培养板中，每种菌液吸取3个孔作为重复。若平行试验中含有回补株，则利用含有pBAD24空质粒的缺失株与野生株进行生长曲线测定，但在培养过程中需加入0.02 mg/mL氯霉素以及0.02%阿拉伯糖。利用多功能酶标仪测量菌液的OD600值，每1 h测一次，连续测12 h，利用GraphPad Prism 8.0进行作图得到各菌株的生长曲线。若测定高渗透条件下各菌的生长曲线，则在MLB培养基中加入7% NaCl；若测定酸碱条件下各菌的生长曲线，则在MLB培养基中加入一定体积的0.2 mol/L盐酸或 1 mol/L氢氧化钠，利用pH计将培养基的pH值调至所需要的数值，具体测定方法同上。
1.5 细菌总RNA提取和qRT-PCR将菌株接到10 mL MLB液体培养基(pH 9.0)中，37 °C培养8 h左右，使细菌达到生长对数期后，台式离心机4 500 r/min离心5 min收集菌体。用Trizol法提取菌体总RNA[19]。利用反转录试剂盒去除基因组DNA并生成cDNA。qRT-PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(表3)，利用7300型实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR。荧光定量PCR体系：cDNA 4.0 μL，Green Premix Ex Taq II 12.0 μL，Primer-F 1.6 μL，Primer-R 1.6 μL，ROX Reference Dye 0.8 μL。设置反应程序：预变性95 °C 30 s；循环反应95 °C 5 s和60 °C 30 s，共35个循环；熔解曲线95 °C 15 s、60 °C 60 s和95 °C 15 s。使用2–ΔΔCt 法计算基因的转录水平。得到数据后利用GraphPad Prism 8.0进行作图分析。
| Primers | Sequences (5′→3′) |
| qRT-PCR-vp1218-F | CTCAGTGCGTATCATCCAAGAG |
| qRT-PCR-vp1218-R | GGCGTATGTGGTGTGTACTT |
| qRT-PCR-vp0493-F | GGGATCAGCTACCACTTCAAT |
| qRT-PCR-vp0493-R | AGGCTACTGTCTTCGGTTTG |
| qRT-PCR-vpa1745-F | GCGAAAGATTATGGTCGCATTAC |
| qRT-PCR-vpa1745-R | CGCCATAGAAACATCGGAAGA |
| qRT-PCR-vpa0085-F | CACCGTTTCGACAACCAAATC |
| qRT-PCR-vpa0085-R | CAGTTTCATGGCCTGCATTAC |
| qRT-PCR-vpa1308-F | GGTTTCTCTAGTCATCGGTAGC |
| qRT-PCR-vpa1308-R | GACGCTGTCCATCTTGGTAATA |
1.6 荧光检测系统的构建及应用
利用clone manager软件设计引物后进行PCR扩增，得到目的基因阅读框DNA片段并纯化，通过酶切连接方法将该片段连入质粒pBAD24-Amp中以表达该蛋白。利用BProm program (SoftBerry)在线预测靶基因的启动子序列，利用同样的方法将待测基因启动子连入到质粒pBBR-lux中。待2个重组质粒测序无误后，利用三亲接合的方法将两者同时导入大肠杆菌中，随后涂布到含氨苄青霉素(0.10 mg/mL)和氯霉素(0.02 mg/mL)双抗的LB平板上，挑取单菌落37 °C振荡培养过夜。将含有双质粒的大肠杆菌1:100转接至LB液体培养基中，分别加入到细胞培养板和荧光板中，每个孔中加200 μL，每种菌株取3个重复，静置培养。9 h后测量各菌的OD600值和荧光值Lux。最终各菌的荧光强度=Lux/OD600。利用GraphPad Prism 8.0进行作图分析。所需引物见表4。
| Primer | Sequences (5′→3′) |
| pBAD24-vp0154-F | GCTCTAGATTACGACTCTTTGCCGTCTGGGACAAATAC |
| pBAD24-vp0154-R | GGGGTACCCGTCAATAGATGCTTCTGAAAGGATGTTTC |
| pBAD24-vp2184-F | GCTCTAGATAGGCTCTGGTTTTTATTTTTGTATCATTT |
| pBAD24-vp2184-R | GGGGTACCCCATAATTGGTAATTTAATGTGTCTGGAAA |
| P-lux-vp2184-F | GGACTAGTATTTCCAGACACATTAAATTACCAATTATG |
| P-lux-vp2184-R | CGAGCTCCAAAAAACAAAATTATTTAAGTTATTATTTTTG |
| P-lux-vp0493-F | CGAGCTCCCCTTCCTCCGATGTATTTTCTTAATTTTT |
| P-lux-vp0493-R | GACTAGTTCCTTGTGTCTAACTTTTTTATTAGTATCT |
| P-lux-vpa0085-F | GACTAGTTTTGAAACACCATTTTATTTTATAATAAAT |
| P-lux-vpa0085-R | CGAGCTCTCATGGTTCCTCCACCTTGAAGGAAGTCGT |
1.7 数据分析
利用GraphPad Prism 8.0 软件中的Student’st-test统计学方法分析数据并作图(*：P<0.05；***：P<0.001)。
2 结果与分析 2.1 副溶血弧菌EnvZ/OmpR双组分系统的鉴定利用SMART在线工具(https://smart.embl.de/)对副溶血弧菌vp0154与vp0155基因的编码蛋白进行结构域分析发现，VP0154蛋白具有REC与Trans_reg_C结构域(图1A)，这2个结构域均属于响应调节蛋白RR的保守性结构域[8,20]；VP0155蛋白具有HAMP、HisKA和HATPase_c结构域(图1A)，这3个结构域均属于组氨酸激酶HK的保守性结构域[8,20]。通过蛋白序列同源分析发现，VP0154蛋白分别与霍乱弧菌和大肠杆菌OmpR蛋白的同源性高达92%与84%；VP0155蛋白分别与霍乱弧菌和大肠杆菌EnvZ蛋白的同源性高达78%与50% (图1B)。这些结果充分说明副溶血弧菌vp0155/vp0154基因是编码EnvZ/OmpR双组分系统的同源蛋白。
|
| 图 1 副溶血弧菌EnvZ/OmpR双组分系统的鉴定 Figure 1 Identification of EnvZ/OmpR TCS in V.parahaemolyticus.A: the conserved domains of the VP0154 and VP0155 protein, as determined using the SMART online server; B: homology analyses of the VP0154 and VP0155 proteins by the protein BLAST algorithm. The identities of the amino acid sequences encoded by each gene are shown among V.parahaemolyticus strain RIMD 2210633, V. cholerae strain MS6, andE. coli strain MG1655. |
2.2 OmpR促进副溶血弧菌抵抗高渗透胁迫和碱胁迫
通过分别构建基因缺失株ΔenvZ与ΔompR以及相应回补株CΔenvZ与CΔompR，检测这些菌株与野生株(WT)在不同培养条件下的生长能力。结果显示，在副溶血弧菌常规培养基MLB中，与WT相比，菌株ΔenvZ与ΔompR的生长能力无明显差异(图2A)；在高渗透压环境中，ΔompR菌株的生长能力明显弱于WT，而CΔompR以及ΔenvZ和CΔenvZ菌株的生长能力与WT类似(图2B)。通过改变MLB培养基的酸碱性，检测EnvZ/OmpR双组分系统对副溶血弧菌抵抗酸碱应激的作用。结果显示，在酸性环境中，ΔompR菌株在对数期早期阶段的生长能力明显弱于WT，但在对数期晚期及稳定期的生长能力则与WT无明显差异，此外CΔompR以及ΔenvZ和CΔenvZ菌株的生长能力与WT的生长能力在整个生长期均无明显差异(图2C)；在碱性环境中，ΔompR菌株的生长能力明显弱于WT，但CΔompR以及ΔenvZ和CΔenvZ菌株的生长能力与WT类似(图2D)。这些结果说明OmpR可以协助副溶血弧菌抵抗高渗透胁迫和碱胁迫。
|
| 图 2 各菌株在不同条件下的生长能力比较 Figure 2 Growing curves of V.parahaemolyticus strains in different environments.A: MLB; B: osmotic-shock; C: acid-shock; D: alkaline-shock. |
2.3 OmpR调控孔道蛋白转录参与副溶血弧菌抵抗碱胁迫
通过qRT-PCR试验检测EnvZ/OmpR双组分系统是否调控副溶血弧菌孔道蛋白表达。结果如图3A所示，在ΔompR菌株中，vp1218、vp0493、vpa1745、vpa0085与vpa1308基因转录水平均明显低于WT菌株。随后，通过构建这些基因缺失株，在常规MLB培养基中检测这些菌株的生长能力，结果显示，除Δvpa1308菌株的生长能力明显弱于WT外，其余孔道蛋白基因缺失株(Δvp0493、Δvp1218、Δvpa0085与Δvpa1745)的生长能力与WT类似(图3B)。我们对在常规MLB培养基中生长能力未减弱的缺失株进行碱胁迫试验发现，Δvp0493、Δvp1218、Δvpa0085与Δvpa1745菌株在碱性环境中的生长能力均明显低于WT菌株(图3C)。这些结果提示OmpR通过这些调控孔道蛋白基因(vp1218、vp0493、vpa1745与vpa0085)的转录，进而影响副溶血弧菌抵抗碱胁迫。
|
| 图 3 各孔道蛋白在ΔompR菌株中转录变化及对副溶血弧菌抗碱胁迫的影响 Figure 3 The porins were regulated by OmpR and contribute to the fitness at the alkaline-shock environment.A: the transcription levels of the porin genes in WT and ΔompR strains were measured by qRT-PCR. qRT-PCR expression values are presented as the means plus standard deviations from three independent experiments. B: growing curves of V.parahaemolyticus strains in MLB; C: growing curves of V.parahaemolyticus strains in an alkaline-shock environment. |
2.4 OmpR通过AphB调控部分孔道蛋白的转录表达
在大肠杆菌中导入可表达OmpR蛋白的pBAD24-ompR质粒与含有aphB(vp2184)基因启动子区域的荧光质粒PaphB-lux，通过检测荧光强度来分析OmpR对aphB基因是否存在转录调控。结果如图4A所示，在表达OmpR蛋白的大肠杆菌中，其荧光强度显著低于无OmpR蛋白(含pBAD24空质粒)的大肠杆菌。构建ΔaphB菌株，并检测其抗碱胁迫能力发现，ΔaphB菌株的抵抗碱胁迫的能力明显高于WT菌株(图4B)。这说明OmpR可抑制AphB的表达，并且AphB蛋白本身具有抑制副溶血弧菌抵抗碱胁迫的能力。此外，通过同样的方法检测了AphB蛋白对上述孔道蛋白的转录调控，结果显示AphB蛋白可显著抑制vp0493和vpa0085基因的表达(图4C−4D)。由于含有其他孔道蛋白启动子的荧光质粒在大肠杆菌中的荧光值很低(数据未展示)，故未检测AphB蛋白对这些基因的调控作用。以上结果提示OmpR蛋白可通过抑制AphB蛋白的表达，以促进部分孔道蛋白的表达，从而增强副溶血弧菌抵抗碱胁迫的能力。
|
| 图 4 AphB受OmpR调控并影响孔道蛋白基因vp0493与vpa0085的转录 Figure 4 AphB was regulated by OmpR and affected the expression of gene vp0493 and vpa0085.A: the regulation of OmpR to aphB was assessed by measuring luminescence in E. coli strain containing the pBAD24-ompR and PaphB-lux plasmids; B: growing curves of WT and ΔaphB strains in an alkaline-shock environment; C−D: The regulation of AphB to gene vp0493 or vpa0085 was assessed by measuring luminescence in E. coli strain containing the pBAD24-aphB and Pvp0493-lux or Pvpa0085-lux plasmids. *: P<0.05; ***: P<0.001. |
3 讨论与结论
副溶血弧菌具有强大的环境适应力，这与其高效而精密的调节系统密切相关。TCS可通过感应外部环境变化调节细菌体内基因表达水平，从而调控细菌对外部环境的适应力[9]。我们的研究发现副溶血弧菌依赖双组分系统EnvZ/OmpR调节对高渗透压和碱性环境的适应力，这与该TCS在多种细菌中所报道的结果一致[10,13]。然而，我们同时发现双组分系统EnvZ/OmpR的2个组分蛋白，即EnvZ与OmpR，在该过程中未发挥相似的功能。对于典型的TCS，其信号传递可分成3步。首先，由位于HK氮端的激酶催化核心来完成信号检测和传递；其次，HK一旦检测到环境信号就会进行自身磷酸化，并将磷酸转基团移到RR；最后，RR与靶基因序列结合，通过调节靶基因表达而促进细菌产生适应外界环境的生理变化[9,13]。由于在高渗透压和碱性环境中，ΔompR菌株的生长能力均明显低于WT，而ΔenvZ菌株的生长能力则始终与WT类似，这说明OmpR蛋白在增强细菌适应高渗透压胁迫和碱胁迫中发挥了主要功能，也间接说明EnvZ与OmpR蛋白之间的信号传递可能存在不专一性。在大肠杆菌中，研究人员发现EnvZ/OmpR可接受其他TCS蛋白(如ArcB)的磷酸基团[21]，或者与其他TCS(如CpxAR)存在交互作用[22]，这在一定程度上提示EnvZ的磷酸化不具有很强专一性。此外，在小肠结肠炎耶尔森菌中，研究人员发现OmpR蛋白在调控致病因子inv表达过程中同样不依赖于EnvZ[23]。因此，在细菌体内还存在其他途径影响OmpR蛋白的磷酸化，这使得OmpR可独立于EnvZ调控下游基因表达，进而协助副溶血弧菌抵抗高渗透胁迫和碱胁迫。
细菌的细胞膜属于高度选择性的渗透性屏障，位于膜上的孔道蛋白(porin)可显著影响细胞膜的通透性[24–25]。孔道蛋白是细菌表面一种非特异性的跨膜水溶性通道，可参与细菌对小分子药物、代谢产物以及离子的外排，并调节细菌的渗透压和酸碱性[24–26]。在大肠杆菌中，EnvZ/OmpR双组分系统可调控孔道蛋白基因ompF和ompC的表达，以响应生长环境中的渗透压变化[27]。为研究EnvZ/OmpR调控副溶血弧菌抵抗碱胁迫的作用机制，我们在副溶血弧菌基因组中筛选了部分孔道蛋白，并分析了EnvZ/OmpR对这些孔道蛋白的转录调控。我们发现OmpR蛋白可促进vp1218、vp0493、vpa1745、vpa0085与vpa1308基因的转录表达。后续碱胁迫试验进一步发现VP1218、VP0493、VPA1745与VPA0085这4个孔道蛋白参与了副溶血弧菌抵抗碱胁迫过程。由于这些孔道蛋白缺失株均属于阅读框内基因序列缺失，且根据该基因两侧基因的转录方向，在阅读框内保留了30、60、150 bp的碱基。因此，该基因缺失理论上不影响两侧基因的转录表达，这也进一步提示这些孔道蛋白本身参与了副溶血弧菌抵抗碱胁迫过程。因此，在副溶血弧菌中，EnvZ/OmpR可调控这些孔道蛋白表达，进而调节副溶血弧菌对碱胁迫的适应力。
AphB蛋白属于LysR家族转录调控因子，在霍乱弧菌中该蛋白可与AphA蛋白共同激活毒力因子的表达[28–29]。有研究表明，AphB蛋白可参与调控细菌pH动态平衡相关基因的转录，其中包括酸耐受基因cadC、cadBA和clcA等[28,30–31]。在霍乱弧菌中，碱性pH可激活OmpR蛋白，并因此抑制AphB蛋白的表达，从而调节细菌对cadC、cadBA和clcA的表达，增强细菌对碱性环境的适应力[12]。在副溶血弧菌中，目前尚没有关于AphB蛋白的报道。本研究发现OmpR蛋白可显著抑制AphB的表达，并且AphB蛋白本身具有抑制副溶血弧菌抵抗碱胁迫的能力。另外，我们发现AphB蛋白可显著抑制VP0493与VPA0085这2个孔道蛋白的表达。由于这2个孔道蛋白可参与副溶血弧菌抵抗碱胁迫的过程，这说明OmpR蛋白可通过抑制AphB蛋白的表达，以促进部分孔道蛋白的表达，从而增强副溶血弧菌抵抗碱胁迫的能力。
本研究通过分析双组分系统EnvZ/OmpR对副溶血弧菌抵抗碱胁迫的作用机制，发现该TCS可通过抑制下游调控因子AphB的转录，以影响孔道蛋白的表达，从而调节副溶血弧菌对碱胁迫的适应力。该研究将为进一步探究副溶血弧菌抵抗外部环境胁迫，提高生存能力的机制提供了理论基础。
| [1] | Baker-Austin C, Oliver JD, Alam M, Ali A, Waldor MK, Qadri F, Martinez-Urtaza J. Vibrio spp. infections. Nature Reviews Disease Primers, 2018, 4(1): 8. |
| [2] | Li L, Meng H, Gu D, Li Y, Jia M. Molecular mechanisms of Vibrio parahaemolyticus pathogenesis. Microbiological Research, 2019, 222: 43-51. DOI:10.1016/j.micres.2019.03.003 |
| [3] |
Liu DL, Liu CH, Shi Y, Liu YJ. Pathogenic analysis of the first imported infectious diarrhea by Vibrio parahaemolyticus, Xi’an. Modern Preventive Medicine, 2019, 46(13): 2483-2487.
(in Chinese) 刘东立, 刘长宏, 石一, 刘永杰. 西安口岸首例输入性副溶血性弧菌感染性腹泻病原学分析. 现代预防医学, 2019, 46(13): 2483-2487. |
| [4] | Pang R, Li Y, Chen M, Zeng H, Lei T, Zhang J, Ding Y, Wang J, Wu S, Ye Q, Zhang J, Wu Q. A database for risk assessment and comparative genomic analysis of foodborne Vibrio parahaemolyticus in China. Scientific Data, 2020, 7(1): 321. DOI:10.1038/s41597-020-00671-3 |
| [5] |
Zong H, Zeng DW, Yin J, Jiang XY, Xu L. Analysis on correlation between Vibrio parahaemolyticus and Vibrio parahaemolyticus in aquatic products and diarrhea patients in Nanan district of Chongqing city. Journal of Modern Medicine & Health, 2020, 36(15): 2339-2342.
(in Chinese) 宗华, 曾德唯, 殷静, 姜欣余, 许磊. 重庆市南岸区水产品和腹泻患者副溶血弧菌相关性分析. 现代医药卫生, 2020, 36(15): 2339-2342. DOI:10.3969/j.issn.1009-5519.2020.15.012 |
| [6] | Chiang ML, Chou CC, Chen HC, Tseng YT, Chen MJ. Adaptive acid tolerance response of Vibrio parahaemolyticus as affected by acid adaptation conditions, growth phase, and bacterial strains. Foodborne Pathogens and Disease, 2012, 9(8): 734-740. DOI:10.1089/fpd.2011.1112 |
| [7] | Yeung PS, Boor KJ. Effects of acid stress on Vibrio parahaemolyticus survival and cytotoxicity. Journal of Food Protection, 2004, 67(7): 1328-1334. DOI:10.4315/0362-028X-67.7.1328 |
| [8] | Jacob-Dubuisson F, Mechaly A, Betton JM, Antoine R. Structural insights into the signalling mechanisms of two-component systems. Nature Reviews Microbiology, 2018, 16(10): 585-593. DOI:10.1038/s41579-018-0055-7 |
| [9] | Buschiazzo A, Trajtenberg F. Two-component sensing and regulation: how do histidine kinases talk with response regulators at the molecular level. Annual Review of Microbiology, 2019, 73: 507-528. DOI:10.1146/annurev-micro-091018-054627 |
| [10] | Tipton KA, Rather PN. An ompR-envZ two-component system ortholog regulates phase variation, osmotic tolerance, motility, and virulence in Acinetobacter baumannii strain AB5075. Journal of Bacteriology, 2017, 199(3): e00705-16. |
| [11] | Chakraborty S, Kenney LJ. A new role of OmpR in acid and osmotic stress in Salmonella and E. coli. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 2656. DOI:10.3389/fmicb.2018.02656 |
| [12] | Kunkle DE, Bina XR, Bina JE. Vibrio cholerae OmpR contributes to virulence repression and fitness at alkaline pH. Infection and Immunity, 2020, 88(6): e00141-e00120. |
| [13] | Cai SJ, Inouye M. EnvZ-OmpR interaction and osmoregulation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(27): 24155-24161. DOI:10.1074/jbc.M110715200 |
| [14] | Slauch JM, Garrett S, Jackson DE, Silhavy TJ. EnvZ functions through OmpR to control porin gene expression in Escherichia coli K-12. Anatolian Journal of Cardiology, 1988, 170(1): 439-441. |
| [15] | Silva IN, Pessoa FD, Ramires MJ, Santos MR, Becker JD, Cooper VS, Moreira LM. The OmpR regulator of Burkholderia multivorans controls mucoid-to-nonmucoid transition and other cell envelope properties associated with persistence in the cystic fibrosis lung. Journal of Bacteriology, 2018, 200(17): e00216-e00218. |
| [16] | Quinn HJ, Cameron AD, Dorman CJ. Bacterial regulon evolution: distinct responses and roles for the identical OmpR proteins of Salmonella typhimurium and Escherichia coli in the acid stress response. Microbial Biotechnology, 2014, 10(3): e1004215. |
| [17] | Gao H, Zhang Y, Han Y, Yang L, Liu X, Guo Z, Tan Y, Huang X, Zhou D, Yang R. Phenotypic and transcriptional analysis of the osmotic regulator OmpR in Yersinia pestis. BMC Microbiology, 2011, 11: 39. DOI:10.1186/1471-2180-11-39 |
| [18] | Zhong X, Lu Z, Wang F, Yao N, Shi M, Yang M. Characterization of GefA, a GGEEF domain-containing protein that modulates Vibrio parahaemolyticus motility, biofilm formation, and virulence. Applied and Environmental Microbiology, 2022, 88(6): e0223921. DOI:10.1128/aem.02239-21 |
| [19] | Zhong X, Lu R, Liu F, Ye J, Zhao J, Wang F, Yang M. Identification of LuxR family regulators that integrate into quorum sensing circuit in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 691842. DOI:10.3389/fmicb.2021.691842 |
| [20] | Stock AM, Robinson VL, Goudreau PN. Two-component signal transduction. Annual Review of Biochemistry, 2000, 69: 183-215. DOI:10.1146/annurev.biochem.69.1.183 |
| [21] | Matsubara M, Kitaoka SI, Takeda SI, Mizuno T. Tuning of the porin expression under anaerobic growth conditions by his-to-Asp cross-phosphorelay through both the EnvZ-osmosensor and ArcB-anaerosensor in Escherichia coli. Genes to Cells, 2000, 5(7): 555-569. DOI:10.1046/j.1365-2443.2000.00347.x |
| [22] | Siryaporn A, Goulian M. Cross-talk suppression between the CpxA-CpxR and EnvZ-OmpR two-component systems in E. coli. Molecular Microbiology, 2008, 70(2): 494-506. DOI:10.1111/j.1365-2958.2008.06426.x |
| [23] | Brzostek K, Brzóstkowska M, Bukowska I, Karwicka E, Raczkowska A. OmpR negatively regulates expression of invasin in Yersinia enterocolitica. Microbiology:Reading,England, 2007, 153(pt 8): 2416-2425. |
| [24] | Vergalli J, Bodrenko IV, Masi M, Moynié L, Acosta-Gutiérrez S, Naismith JH, Davin-Regli A, Ceccarelli M, Van Den Berg B, Winterhalter M, Pagès JM. Porins and small-molecule translocation across the outer membrane of Gram-negative bacteria. Nature Reviews Microbiology, 2020, 18(3): 164-176. DOI:10.1038/s41579-019-0294-2 |
| [25] | Masi M, Winterhalter M, Pagès JM. Outer membrane porins. Subcellular Biochemistry, 2019, 92: 79-123. |
| [26] | Li Z, Jiang B, Zhang X, Yang Y, Hardwidge PR, Ren W, Zhu G. The role of bacterial cell envelope structures in acid stress resistance in E. coli. Applied Microbiology and Biotechnology, 2020, 104(7): 2911-2921. DOI:10.1007/s00253-020-10453-x |
| [27] | Sadotra S, Lou YC, Tang HC, Chiu YC, Hsu CH, Chen C. Structural basis for promoter DNA recognition by the response regulator OmpR. Journal of Structural Biology, 2021, 213(1): 107638. DOI:10.1016/j.jsb.2020.107638 |
| [28] | Kovacikova G, Lin W, Skorupski K. The LysR-type virulence activator AphB regulates the expression of genes in Vibrio cholerae in response to low pH and anaerobiosis. Journal of Bacteriology, 2010, 192(16): 4181-4191. DOI:10.1128/JB.00193-10 |
| [29] | Liu Z, Yang M, Peterfreund GL, Tsou AM, Selamoglu N, Daldal F, Zhong Z, Kan B, Zhu J. Vibrio cholerae anaerobic induction of virulence gene expression is controlled by thiol-based switches of virulence regulator AphB. PNAS, 2011, 108(2): 810-815. DOI:10.1073/pnas.1014640108 |
| [30] | Merrell DS, Camilli A. Regulation of Vibrio cholerae genes required for acid tolerance by a member of the “ToxR-like” family of transcriptional regulators. Journal of Bacteriology, 2000, 182(19): 5342-5350. DOI:10.1128/JB.182.19.5342-5350.2000 |
| [31] | Dutzler R. The ClC family of chloride channels and transporters. Current Opinion in Structural Biology, 2006, 16(4): 439-446. DOI:10.1016/j.sbi.2006.06.002 |