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丙酮酸是一种重要的有机酸,在食品、化工和医药等领域广泛应用。酶法合成丙酮酸存在酶活性低的问题,严重制约着丙酮酸的工业化生产。低通量的筛选方法是筛选高活性酶突变体的瓶颈,生物传感器能够为酶的分子改造提供高通量的筛选方法。本研究以大肠杆菌的转录因子PdhR为研究对象,构建响应丙酮酸的生物传感器。首先,将PdhR的结合位点插入3个启动子的不同位置构建杂合启动子并验证其响应活性,结果表明杂合启动子PtacD、PticM和PtrpD具有较好的响应活性。其次,通过优化PdhR表达量改善生物传感器的响应性能,其中生物传感器B2-1能灵敏地响应丙酮酸的浓度变化,具有较宽的配体检测范围(0–12 g/L丙酮酸),其荧光响应倍数为14。最后,生物传感器B2-1的配体特异性分析表明生物传感器B2-1仅响应丙酮酸,对其他酮酸不敏感,具有较强的配体特异性。因此,本研究构建的响应丙酮酸的生物传感器可用于高活性酶突变体的高通量筛选,为酶和菌种的分子改造提供了高效、灵敏的筛选工具,进一步为丙酮酸的工业化生产奠定了基础。… … 相似文献
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罗氏真养产碱杆菌(Cupriavidus necator)是一种兼性化能自养细菌,属于变形菌门(Proteobacteria) β变形菌亚纲,该菌能利用CO2化能自养生长,生产聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHA)等产物。在全球碳减排的背景下,该菌在利用CO2生产有机酸、PHA及次级代谢产物等关键生物基产品方面有望发挥重要作用。自20世纪90年代代谢工程理念提出以来,尤其是代谢工程使能技术的创新及发展,极大地促进了C.necator细胞工厂的构建及其在工业发酵领域的应用。本文系统介绍了近年来C. necator H16代谢工程技术的发展,及其在生物基化学品细胞工厂构建中的应用,最后讨论了C.necator H16代谢工程中关键问题并展望其未来发展前景,可为增强C. necator H16代谢工程的研究提供思路,促进其在二氧化碳转化和生物制造中更广泛的应用。… … 相似文献
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大肥菇胞内多糖(IPS)具有较优的抗缺氧活性,但由于分子量过大不能被人体直接吸收,为进一步从小分子层面去研究大肥菇胞内多糖的抗缺氧机理,作者以缺氧条件下喂养的雄性小鼠和雌性小鼠的肠道菌群构建体外低氧酵解模型,优化了条件,并解析了多糖在不同性别小鼠肠道菌群中的消化特征。雄性小鼠组(… … 相似文献
邱松林;胡世成;童彩玲;焦迎春 《菌物学报》2025,44(5):240274-118
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【背景】大肠杆菌（Escherichia coli）为革兰氏阴性菌,广泛存在于肉鸡的肠道、排泄物、土壤、水和空气中。【目的】研究季节对大肠杆菌的流行情况和耐药性的影响。【方法】对3个定点肉鸡养殖场开展夏季和冬季大肠杆菌流行病学调查,以问卷形式调研3个养殖场基本情况,平板法分离大肠杆菌,对分离株开展14种抗菌药物最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）的测定,检测分离株的耐药基因和毒力基因携带情况,最终采用统计学方法实证季节与大肠杆菌分离率的相关性、季节与细菌耐药性的相关性、耐药基因与耐药表型相关性。【结果】3个养殖场大肠杆菌总分离率为94.7%（284/300）,A养殖场>C养殖场>B养殖场（100.0%>93.0%>91.0%）,同一养殖场夏季和冬季的大肠杆菌分离率的统计学结果无显著差异（P>0.05）,A养殖场分离率显著大于B和C养殖场（P<0.05）;3个养殖场大肠杆菌分离株表现出多重耐药性,菌株对氨苄西林、头孢噻吩、卡那霉素、四环素、环丙沙星、磺胺甲噁唑、复方新诺明和氟苯尼考高度耐药,并且夏季分离株比冬季分离株耐药率高;进一步采用配对法t检验实证季节与细菌耐药性的相关性,发现仅多黏菌素E耐药性表现季节差异（P<0.05）;耐药基因检出率最高的基因为floR,其次为qnrS和mcr-1,bla NDM和aac（6'）-Ib检出率较低,cfr基因未检出,3个养殖场基因检出情况与季节相关性不完全一致,耐药表型与基因型相关性分析发现,floR基因与氟苯尼考耐药呈显著正相关（P<0.05）,bla NDM基因与氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸耐药呈显著正相关（P<0.05）,mcr-1基因与多黏菌素E耐药呈显著正相关（P<0.05）,qnrS基因与环丙沙星耐药呈显著正相关（P<0.05）;17个毒力基因分析表明fim C、yij P、mat A和iss检出率在70%以上,共有2株大肠杆菌被定义为致病性大肠杆菌。【结论】大肠杆菌在肠道的定殖不受季节影响,肉鸡养殖场大肠杆菌多重耐药性普遍,夏季大肠杆菌分离株比冬季分离株耐药情况严峻,大肠杆菌对多黏菌素E的耐药性与季节有关,细菌耐药性与耐药基因之间存在密切相关性,研究成果提示可在夏季加强细菌耐药性监测,指导肉鸡养殖规范和精准用药,为肉鸡大肠杆菌病防治和合理用药提供参考。… … 相似文献
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丁二酸是一种重要的高值平台化合物,广泛应用于化工、食品、医药等多个领域。化学法生产丁二酸具有高污染、高碳排放等缺陷,因此发酵法成为目前丁二酸生产的主要方法。天然可产丁二酸的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)具有丁二酸产量高、耐高渗、发酵时间短等优势,是一种重要的工业生产菌株。为了进一步提高A. succinogenes的丁二酸产量,降低生产成本,本研究建立了一种基于溴百里酚蓝的简便高通量筛选方法,结合常压室温等离子体诱变的方法对野生菌A. succinogenes进行了定向进化,筛选得到了高产诱变菌株A4-K74。此菌株在摇瓶中厌氧发酵72 h后最高积累56.3 g/L丁二酸,比野生菌株提高了40.8%,且具有良好的遗传稳定性。转录组分析揭示了硫代谢途径以及半胱氨酸等氨基酸合成途径的增强是丁二酸产量提高的潜在原因,为未来代谢工程改造A. succinogenes提供了参考,有利于进一步推进丁二酸的生物法工业化生产。… … 相似文献
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【背景】猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的母猪流产或死胎、仔猪呼吸道症状并伴随死亡率升高的一种传染性疾病。【目的】建立一种特异性强、灵敏度高、操作简捷、检测时间短的PRRSV抗体化学发光检测方法,用于检测PRRSV抗体水平。【方法】以羧基磁珠作为固相载体偶联PRRSV重组N蛋白,用适量的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)进行封闭,加入检测样品进行反应,以兔抗猪IgG-AP抗体作为酶标二抗,加入相应底物进行显色,优化各项反应条件,建立PRRSV抗体化学发光检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性和符合率进行验证。【结果】建立的PRRSV抗体化学发光检测方法的血清样品稀释倍数为1:30,蛋白与羧基磁珠偶联pH值为8.0,蛋白偶联量为20μg/mL,使用20μL 10%BSA溶液封闭最佳,磁珠稀释液用量为1 mL,酶标二抗稀释度为1:20 000,一步反应时间为20 min,二步反应时间为10 min,底物反应时间为3 min。根据背景清晰的PRRSV临床血清样本制标准曲线,通过绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线确定阴阳临界点为32.56 U,当临床PRRSV抗体阳性样品稀释到4倍时,ELISA和化学发光检测方法均鉴定为阴性,说明该化学发光检测方法具有良好的灵敏度。与非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒抗体阳性血清均无交叉反应。重复性试验中,批内变异系数为2.79%-5.32%,批间变异系数为1.05%-11.31%,均<15%,与商品化猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒阳性符合率93.8%,阴性符合率96.3%,总符合率96.1%。【结论】本研究建立的PRRSV抗体化学发光检测方法可用于PRRSV疫苗接种后或感染痊愈后抗体水平检测,为后续试剂盒的开发提供参考。… … 相似文献
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【背景】采后病害是制约热带水果商品产业化发展的一大重要影响因素。【目的】明确采后莲雾致腐病原菌种类,并筛选高效生物抑制剂。【方法】以‘大叶’莲雾果实为试验材料,采用组织分离、科赫氏法则、形态学鉴定和ITS序列同源性分析对果实表面主要致病菌进行分离纯化及鉴定,验证莲雾果实主要致病菌种类,并结合体外和体内试验筛选适宜的高效生物抑制剂。【结果】从莲雾果实中共分离鉴定出5种病原菌,分别是可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia rubropurpurea）、果生刺盘孢菌（Colletotrichum fructicola）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）和棒孢拟盘多毛孢菌（Neopestalotiopsis clavispora）,并且发现木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）能诱发莲雾果实腐烂。体外试验结果表明：0.3 g/L咖啡酸（caffeic acid,CA）对5种不同病原菌的抑菌率最高,水杨酸（salicylic acid,SA）次之,对香豆酸（p-coumaric acid,PCA）抑菌效果最差。体内试验结果表明：CA可以通过延缓莲雾果实硬度（hardness）下降,降低絮状绵软物的生成,维持较高的抗坏血酸（vitamin C,VC）和可滴定酸（titratable acid,TA）含量,降低丙二醛（malondialdehyde,MDA）累积速率,同时降低细胞膜透性,延缓膜脂过氧化,从而维持采后莲雾较好的贮藏品质。【结论】从采后莲雾果实中分离鉴定出5种致病菌,并筛选出有明显抑菌作用的生物抑制剂,为莲雾果实病害防治和采后贮藏保鲜提供了理论参考。… … 相似文献
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γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase, GGT)在临床诊断、食品加工和医药制造等领域应用广泛,然而较低的表达量限制了其广泛应用。为提高GGT表达水平,本研究首先使用MūtCompute软件对来源于地衣芽胞杆菌的GGT进行蛋白质工程改造,获得了催化效率提高的突变体GGTA339C。通过对底物结合口袋进行分析,发现突变体GGTA339C的隧道结构更直,底物结合区域更开放,酶活较对照提高255%。随后,以地衣芽胞杆菌BL11为出发菌株,通过整合表达分子伴侣PrsA,构建了高效分泌GGT的地衣芽胞杆菌BL11::prsA/pPykzA+rbs6-SPSacC-GGTA339C,其GGT酶活达到22.1 U/mL。最后,通过5 L发酵罐进行放大,GGT酶活达180.14 U/mL。本研究获得了高催化性能的突变体GGTA339C,并构建了一株高产GGT的地衣芽胞杆菌BL11::prsA/pPykzA+rbs6-SPSacC-GGTA339C,为GGT工业生产及催化应用奠定了基础。… … 相似文献
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l-乳酸作为一种重要的有机酸,在食品、医药和生物塑料等领域广泛应用。传统的l-乳酸生产主要依赖乳酸菌,但由于乳酸菌对底物要求高且对酸性环境的耐受性差,导致其工业化应用面临一定挑战。相比之下,马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)因其快速生长、耐高温、底物利用广泛等优势,成为了乳酸生产的潜在宿主。为了优化马克斯克鲁维酵母的l-乳酸生产能力,本研究对其进行了代谢工程改造。首先,筛选并表征了高效的乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH),然后利用CRISPR基因编辑技术在不同基因位点过表达LDH并敲除编码丙酮酸脱羧酶的基因PDC1,构建了菌株LA2.1,其l-乳酸产量达到72.55 g/L。通过筛选并组合耐酸靶点,进一步提升了菌株的耐酸性和乳酸产量。最终,通过工艺优化,菌株LA4.3发酵72 h积累了112.41 g/L的l-乳酸,得率为84.00%。在降低CaCO3使用量的条件下,l-乳酸产量达到101.50 g/L,发酵结束后的pH值为3.52。本研究为l-乳酸的高效生产提供了理论基础和技术支持。… … 相似文献
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担子菌类食用真菌的同一个细胞里的2个细胞核具有不同的活跃度,会在原生质体单核化和无性孢子单孢分离中出现核偏分离现象。本文首先以15株金针菇野生菌和2株栽培菌为供试材料,采用原生质体单核化的方法分离单核体。结果表明有13株野生菌(GS0002、GS0049、GS0116、GS014… … 相似文献
王宇;熊惠洋;杨瑞恒;吴莹莹;刘霞;鲍大鹏 《菌物学报》2025,44(5):240304-75