摘要:

摘要:新质蛋白是生物制造技术高速发展背景下产生的新型蛋白资源，其不依赖传统畜牧业或传统渔业方式，具有资源节约、低碳环保、生产效率高等优势，有望部分替代传统动物蛋白，正逐渐成为推动经济发展的重要抓手，对加快发展新质生产力、保障国家粮食安全、落实“大食物观”具有重要意义。本文系统分析了新质蛋白的发展机遇、挑战及现状，可为行业研究、政策制定及产业实践提供参考，助力我国新质蛋白产业高质量发展。

摘要:人工细胞作为一种模拟天然细胞结构和功能的人工系统，在多个领域的研究中发挥着重要作用。基于人工细胞构建策略可分为“自上而下”的人工细胞和“自下而上”的人工细胞。这与以构建或模拟天然生物细胞中存在的复杂路径为目标的“自下而上”的合成生物学思想不谋而合。利用合成生物学“自下而上”的逻辑属性，可以工程化设计人工细胞，并应用于生物工程、医药和疾病治疗等领域。本文重点介绍了人工细胞在合成生物学和医学领域中的应用，尤其是基于人工细胞构建的药物递送系统以及人工细胞在组织工程和再生医学中的应用。同时探讨了如何运用新的工程方法提高人工细胞的活性和稳定性，从而缩小人工细胞与天然细胞之间的差距。本文可为加速和推进多功能人工细胞的研究，将人工细胞的应用范围扩展到生物技术、医学和靶向药物治疗等诸多领域提供参考，为人类社会的可持续性发展提供更多可能性。

摘要:生物传感器由生物识别元件和信号转换元件组成，能将目标化合物的浓度信号转化为易于检测的信号，现已被广泛应用于医药、环境、食品等各个领域。目前，可调节的色氨酸生物传感器在色氨酸及其衍生物的代谢工程和合成生物学研究中发挥着重要的作用，不同色氨酸生物传感器由于工作原理不同，在实际应用中具有各自的优势。本文综述了色氨酸生物传感器的研究进展，主要包括色氨酸生物传感器的类别、作用原理及优化策略，重点介绍了其在合成生物学中的典型应用实例。最后，针对色氨酸生物传感器设计与构建过程中面临的问题，提出了相应的解决方案，并对其发展趋势进行了展望。

摘要:放线菌是一类具有强大次级代谢能力的微生物，对放线菌菌株进行理性改造，对提升其天然产物的生产能力具有重要意义。CRISPR/Cas系统因具有高效性、易操作性和良好的靶向精确性，已成为放线菌基因改造和功能研究的重要工具。本文从工作原理、系统构建、适用场景等角度对放线菌中的各类CRISPR/Cas基因编辑及表达调控工具进行了汇总和比较，包括基于DNA双链断裂的CRISPR/Cas系统、CRISPR干扰系统、CRISPR激活系统，以及CRISPR碱基编辑系统。同时，本文还总结了这些工具在放线菌天然产物生物合成方面的应用情况。CRISPR/Cas工具箱在放线菌中的开发和应用，极大地推动了放线菌微生物学和天然产物相关的研究。

摘要:罗氏真养产碱杆菌(Cupriavidus necator)是一种兼性化能自养细菌，属于变形菌门(Proteobacteria) β变形菌亚纲，该菌能利用CO₂化能自养生长，生产聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHA)等产物。在全球碳减排的背景下，该菌在利用CO₂生产有机酸、PHA及次级代谢产物等关键生物基产品方面有望发挥重要作用。自20世纪90年代代谢工程理念提出以来，尤其是代谢工程使能技术的创新及发展，极大地促进了C.necator细胞工厂的构建及其在工业发酵领域的应用。本文系统介绍了近年来C. necator H16代谢工程技术的发展，及其在生物基化学品细胞工厂构建中的应用，最后讨论了C.necator H16代谢工程中关键问题并展望其未来发展前景，可为增强C. necator H16代谢工程的研究提供思路，促进其在二氧化碳转化和生物制造中更广泛的应用。

摘要:酵母表面展示是一种将目标蛋白在酵母细胞表面表达的技术，已在酿酒酵母、毕赤酵母、解脂耶氏酵母等多个酵母种属中成功建立。该技术为蛋白高通量筛选提供了高效的平台，用于对药物和抗体等候选分子以及高分泌细胞进行快速和准确的评估，已在生物制药、疫苗开发、酶工程和生物材料制备等关键领域广泛应用。本文综述了酵母表面展示技术中针对宿主和表达盒元件的优化策略，并深入探讨了该技术在高通量筛选中的应用。同时，也指出了当前技术的局限性，并对未来的发展方向进行了展望，为进一步提升筛选的准确性和扩大适用范围提供了参考。

摘要:酵母是代谢工程中生产蛋白质、化学品和植物天然产物的重要宿主，挖掘多样化的酵母中性位点对复杂产物的高效细胞工厂的构建和优化具有重要的意义。本文归纳总结了酵母染色体上中性位点的筛选标准、表征手段、强度影响因素，介绍了其在合成生物学和生物制造领域中的应用，并对未来的研究方向进行了展望，为利用中性位点进行酵母细胞工厂的构建优化提供了理论支撑。

摘要:透明质酸(hyaluronic acid, HA)是d-葡萄糖醛酸与N-乙酰葡萄糖胺组成的高聚合线性多糖，不同分子量的透明质酸功能也大不相同。低分子量HA在医疗领域的应用日益广泛，可作为靶向抗肿瘤药物的载体、生产各种伤口敷料、应用于药物传递系统等，具有良好的市场前景与应用价值。本文全面梳理了近年来低分子量透明质酸的研究进展，例如传统的物理、化学降解法制备低分子量透明质酸，诱变育种获得生产低分子量HA的新菌株等，深入探讨了新兴的合成生物学策略在其生产中的应用，例如透明质酸合酶改造、合成代谢途径调控改变底物平衡等，同时指出了当前研究中的难点和挑战。本文为低分子量透明质酸的高效生产提供了新的思路和方法。

摘要:卤代化合物在农业化学、制药、材料等领域有着较高的应用价值，但是传统的化学合成手段往往使用有毒试剂，并可能引发环境污染问题。此外，传统方法还面临区域选择性和立体选择性不足的挑战，导致制备过程较为复杂。相比之下，酶促卤化技术因其高效的催化性能、温和的反应条件以及出色的区域和立体选择性潜力，被认为是绿色卤化工业中更具前景的选择。目前已经表征了多种卤化酶，包括遵循亲电芳香取代机制的亚铁血红素依赖型卤过氧化物酶、钒依赖型卤过氧化物酶和黄素依赖型卤化酶，遵循自由基机制的非血红素铁/α-酮戊二酸依赖型卤化酶和遵循亲核机制的S-腺苷-l-甲硫氨酸依赖型卤化酶。本文综述了各类卤化酶的关键活性位点与催化卤化机理，以及一系列为了提高其应用价值而进行的酶工程改造，最后简要讨论了其工业应用现状。作为一类有前景的生物催化剂，卤化酶可以高效地实现酶促合成及化学酶法合成多种卤代化合物，改善传统化学合成带来的环境污染问题，深入理解其催化机制与改造研究在合成领域具有重要的价值。

摘要:神经毒剂是迄今为止发现的毒性最强的化合物之一，绿色高效降解一直是神经毒剂洗消技术研究中的难点和热点之一。相比于化学焚烧和物理吸附，酶催化具有特异性高、反应条件温和等优势，在环境净化和医疗救治领域展现出巨大潜力。磷酸三酯酶(phosphotriesterase, PTE)具有广泛的底物适应性，是目前已知的唯一能够降解维埃克斯(venomous agent X, VX)神经毒剂的酶，为神经毒剂的生物降解提供了重要的潜在途径。本文全面梳理了神经毒剂性质和磷酸三酯酶结构，详细阐述了理论计算和酶工程技术在神经毒剂降解中的研究进展，展望了神经毒剂酶降解的应用前景，提出了未来研究的方向和挑战，可为设计和开发更高效的降解酶体系提供理论基础和实践指导，推动神经毒剂绿色降解技术进一步发展。

摘要:多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)指含2个或2个以上苯环的芳烃，其致癌、致突变、致畸作用引起了严重的环境问题。微生物降解作为PAHs污染的修复方式之一，具有成本低、效率高、环境友好等优点。而相比于传统的单一菌株降解，混合微生物体系通常降解效果更好，适应性和抗逆性更强。本文综述了从自然环境中获得的各种PAHs降解天然混菌体系以及基于不同单菌成员的降解或其他特性构建的人工混菌体系，对各混菌体系的条件优化方法以及对实际污染场地进行修复的研究进展，并对混合微生物体系降解多环芳烃的未来发展方向进行了展望。

摘要:为应对气候变化，全球开始推动绿色低碳转型。碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)能高效催化CO₂可逆水合反应，并且能在各种金属离子(如Ca²⁺、Mg²⁺)的参与下形成碳酸盐沉积物，生成的碳酸盐沉积物性质稳定，不会再次释放CO₂，并且还能作为胶凝材料应用于裂缝修复、土体加固等领域。因此，利用CA将CO₂转化成碳酸盐是一种很有前景的CO₂封存方法。本文针对CA的种类、催化机理、CA将CO₂矿化成CaCO₃、CA的固定化以及CA介导的生物矿化在裂缝修复、砂土加固等土木工程领域的应用进行了综述，并对如何开发高活性高稳定性的CA以及CA介导的生物矿化在土木工程领域应用的发展趋势进行了展望。

摘要:为应对全球化石能源枯竭及温室效应对人类造成的威胁，微生物利用一碳化合物生产高附加值的化学品，对提高资源利用率和减少碳排放具有重要意义。本文主要总结了4种已在模式微生物中成功构建的一碳(C1)固定途径，包括核酮糖单磷酸途径、木酮糖单磷酸途径、卡尔文循环和还原甘氨酸途径。同时，综述了适应性实验室进化作为一种强有力的策略应用于C1化合物利用菌株进化的具体实例。最后，展望了微生物利用一碳化合物面临的挑战和机遇，为提高C1化合物利用效率提供了思路。

摘要:DNA与蛋白质的相互作用是细胞生命活动的重要机制，是DNA复制和转录调控的基础，对细胞的生长发育和环境适应至关重要。这种相互作用本质上是通过蛋白质的DNA结合结构域特异性识别和结合DNA序列实现的。深入研究和理解这些相互作用不仅有助于揭示生物学机制，也对疾病研究、药物开发、工业菌种设计与改造等具有重要的指导意义。本文综述了传统的DNA-蛋白质相互作用研究方法和近年来发展的新方法，分析其技术原理、优势、局限性和应用案例，也进一步探讨了相关新技术可能的改进方向和潜在应用场景，希望能够帮助研究人员全面、快速地了解不同DNA-蛋白质相互作用研究方法的特点、挑战和未来的发展方向，并为相关方法的进一步创新、融合提供参考。

摘要:二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)是一种ω-3长链多不饱和脂肪酸，因其多种生理活性而备受关注。EPA的传统来源是从深海鱼油中提取，但随着鱼类资源的枯竭和环境污染的加剧，该方法越来越不可持续。为了寻找可持续的绿色生产方式，本研究构建了毕赤酵母异源合成EPA的细胞工厂，通过敲除脂肪酸下游代谢途径和竞争途径提高了工程菌株的总脂肪酸(total fatty acids, TFAs)的积累，同时强化了C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和去饱和酶的表达，工程菌株在以葡萄糖为碳源的条件下积累了677.34 mg/L TFAs、60.81 mg/L EPA。进一步过表达以上3种关键酶，EPA的产量达到68.89 mg/L。同时，使用醇氧化酶启动子P_AOX1替换3个关键酶的葡萄糖启动子P_GAP探究了甲醇诱导下的EPA的合成水平，EPA的产量达到75.21 mg/L。本研究首次实现了在毕赤酵母中从头合成EPA，为构建利用一碳资源甲醇生产EPA的细胞工厂提供了有益参考。

摘要:白藜芦醇是一种有价值的植物多酚类化合物，目前主要通过植物提取法获得，受到天然原料的限制，不易长期大量获取，因此有必要开发一种更加简便、经济的白藜芦醇生产方法。本研究以树干毕赤酵母的野生型菌株为宿主，首先通过引入编码白藜芦醇合成的关键酶基因(HaTAL1、AtPAL2、AtC4H、At4CL2以及VvSTS)得到菌株Ss05，合成白藜芦醇55.28 mg/L。随后通过过表达3-脱氧-d-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(3-deoxy-d-arabino-heptulonate-7-phosphate, DAHP)合成酶突变体SsARO4^K221L及分支酸变位酶突变体SsARO7^G139S、敲除丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)、过表达乙酰辅酶A羧化酶突变体SsACC1^S650A,S1152A，增强对香豆酸及丙二酰辅酶A的供应。在此基础上，进一步增加关键基因的拷贝数得到工程菌株Ss17，白藜芦醇产量提高到150.56 mg/L。最后将工程菌株Ss17在5 L发酵罐中通过分批补料葡萄糖发酵128 h，得到了558.40 mg/L白藜芦醇。本研究运用合成生物学思路，构建利用简单碳源合成白藜芦醇的工程菌株，同时利用生物反应器放大微生物发酵规模，为树干毕赤酵母中芳香族化合物的生物合成提供了重要参考。

摘要:没食子酸是一种具有抗氧化等多种药用价值的天然植物酚类化合物，目前主要的生产方法是通过提取植物中单宁进行化学或酶水解方式制备，存在成本高和污染大的问题。基于微生物细胞工厂的绿色合成为没食子酸生产提供了有效替代途径，然而目前的产量仍难以达到工业化要求。为了利用廉价底物实现没食子酸的从头高效合成，本研究以一株高效合成3-脱氢莽草酸的大肠杆菌为底盘，首先确定没食子酸最优合成路径的关键酶为3-脱氢莽草酸脱水酶(AroZ)及对羟基苯甲酸羟化酶(PobA)，且二者最优表达比例为1:20。基于质粒拷贝数和启动子工程实现最优路径在底盘菌株体内的构建，并结合蛋白质工程改造获得限速酶突变体PobA^M2/A45S/V47P，使得没食子酸摇瓶生产水平达到3.6 g/L。最后，在5 L发酵罐进行菌株稳定性和发酵条件优化，没食子酸产量达到26.7 g/L，糖酸转化率0.15 g/g。本研究实现了以葡萄糖为底物从头合成没食子酸产量的突破，为强化没食子酸及相关植物酚酸的生物合成提供了重要参考。

摘要:乙醇酸是结构最简单的α-羟基酸，广泛应用于医药、化工等领域。然而，目前发酵生产乙醇酸的菌株普遍含有质粒或需要添加诱导剂，不利于大规模工业生产。为了构建无需质粒和化学诱导剂的乙醇酸生产菌株，本研究选择野生型大肠杆菌ATCC 8739作为出发菌株，首先筛选了不同来源的异柠檬酸裂解酶和乙醛酸还原酶，并通过基因组水平整合获得了工程菌株GA01，罐上发酵测试该菌株的乙醇酸产量达到10.12 g/L，经过路径酶拷贝数优化后产量进一步提升至15.25 g/L；其次，通过阻断乙醇酸合成途径的分支代谢路径并强化前体供应，将碳代谢流高效引入乙醇酸合成途径，最优菌株GA07-1的乙醇酸产量提高至41.69 g/L；最后，在5 L发酵罐中进行发酵优化，菌株GA07-1的乙醇酸产量、葡萄糖得率和生产强度分别达到50.62 g/L，0.49 g/g和1.20 g/(h·L)。本研究实现了在无抗生素和化学诱导剂条件下的乙醇酸从头发酵。

摘要:d-塔格糖是一种功能性稀有糖，因其具有热量低、降低血糖、抗龋齿和改善肠道菌群等特性而受到广泛关注。现有的生产d-塔格糖的方法仍存在生产效率低、成本高等问题。为了解决这一问题，本研究通过在大肠杆菌中构建双酶高效表达系统，实现了全细胞高效催化乳糖合成d-塔格糖。l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinose isomerase, l-AI)是生物合成法中催化半乳糖异构化生成d-塔格糖的关键酶。本研究首先通过对不同来源的l-AI进行筛选，发现来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) CGMCC 2921的l-AI具有较好的催化能力。通过对LfAI进行理性设计，获得最优突变体D390V/V468L，在最适40 ℃条件下，其半衰期延长至72 h，酶活提高了36.68%。随后，以pET28a为载体，通过启动子优化，将最优突变体基因(LfaraA^D390V/V468L)和大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶基因(EclacZ)在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中串联表达，建立双酶偶联全细胞体系。最后，通过优化全细胞催化体系，在5 L发酵罐的最优条件(pH 7.0、温度50 ℃、2.5 mmol/L Mn²⁺)下，以500 g/L乳糖为底物转化48 h获得115.21 g/L d-塔格糖，转化率为23.09%。本研究利用重组全细胞催化法以乳糖为底物合成d-塔格糖，展现出了显著的工业应用潜力和 价值。

摘要:丁二酸是一种重要的高值平台化合物，广泛应用于化工、食品、医药等多个领域。化学法生产丁二酸具有高污染、高碳排放等缺陷，因此发酵法成为目前丁二酸生产的主要方法。天然可产丁二酸的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)具有丁二酸产量高、耐高渗、发酵时间短等优势，是一种重要的工业生产菌株。为了进一步提高A. succinogenes的丁二酸产量，降低生产成本，本研究建立了一种基于溴百里酚蓝的简便高通量筛选方法，结合常压室温等离子体诱变的方法对野生菌A. succinogenes进行了定向进化，筛选得到了高产诱变菌株A4-K74。此菌株在摇瓶中厌氧发酵72 h后最高积累56.3 g/L丁二酸，比野生菌株提高了40.8%，且具有良好的遗传稳定性。转录组分析揭示了硫代谢途径以及半胱氨酸等氨基酸合成途径的增强是丁二酸产量提高的潜在原因，为未来代谢工程改造A. succinogenes提供了参考，有利于进一步推进丁二酸的生物法工业化生产。

摘要:l-乳酸作为一种重要的有机酸，在食品、医药和生物塑料等领域广泛应用。传统的l-乳酸生产主要依赖乳酸菌，但由于乳酸菌对底物要求高且对酸性环境的耐受性差，导致其工业化应用面临一定挑战。相比之下，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)因其快速生长、耐高温、底物利用广泛等优势，成为了乳酸生产的潜在宿主。为了优化马克斯克鲁维酵母的l-乳酸生产能力，本研究对其进行了代谢工程改造。首先，筛选并表征了高效的乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)，然后利用CRISPR基因编辑技术在不同基因位点过表达LDH并敲除编码丙酮酸脱羧酶的基因PDC1，构建了菌株LA2.1，其l-乳酸产量达到72.55 g/L。通过筛选并组合耐酸靶点，进一步提升了菌株的耐酸性和乳酸产量。最终，通过工艺优化，菌株LA4.3发酵72 h积累了112.41 g/L的l-乳酸，得率为84.00%。在降低CaCO₃使用量的条件下，l-乳酸产量达到101.50 g/L，发酵结束后的pH值为3.52。本研究为l-乳酸的高效生产提供了理论基础和技术支持。

摘要:γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase, GGT)在临床诊断、食品加工和医药制造等领域应用广泛，然而较低的表达量限制了其广泛应用。为提高GGT表达水平，本研究首先使用MūtCompute软件对来源于地衣芽胞杆菌的GGT进行蛋白质工程改造，获得了催化效率提高的突变体GGT^A339C。通过对底物结合口袋进行分析，发现突变体GGT^A339C的隧道结构更直，底物结合区域更开放，酶活较对照提高255%。随后，以地衣芽胞杆菌BL11为出发菌株，通过整合表达分子伴侣PrsA，构建了高效分泌GGT的地衣芽胞杆菌BL11::prsA/pP_ykzA+rbs6-SP_SacC-GGT^A339C，其GGT酶活达到22.1 U/mL。最后，通过5 L发酵罐进行放大，GGT酶活达180.14 U/mL。本研究获得了高催化性能的突变体GGT^A339C，并构建了一株高产GGT的地衣芽胞杆菌BL11::prsA/pP_ykzA+rbs6-SP_SacC-GGT^A339C，为GGT工业生产及催化应用奠定了基础。

摘要:朱砂精酸(cinnabarinic acid, CA)是一种广泛用于印染、化工和制药等行业的高值含氮三杂环吩恶嗪酮类化合物，但至今尚未建立有效的CA合成体系。为实现CA的高效合成，本研究构建了基于体外酶学催化和全细胞催化的CA生物合成体系。首先，针对CA合成的关键限制因素，筛选到了一个可加速将3-羟基邻氨基苯甲酸转化为CA的超氧化物歧化酶SodA_Prm。随后，通过对SodA_Prm催化条件的优化，于体外实现了高达(176.6±14.3) mg/L的CA合成。此后，基于SodA_Prm酶，构建了用于CA合成的全细胞催化体系BL-sodA_Prm。最后，通过对全细胞催化系统BL-sodA_Prm催化条件的优化，最终实现了高达312.3 mg/L的CA合成。本研究为未来CA及其衍生物的高效合成与应用奠定了研究基础。

摘要:氨肽酶是食品和医药等领域用于蛋白质深度水解的常用协同酶，但因发酵活力低且热稳定性差，限制了其工业应用范围。本研究通过理性设计提高枯草芽孢杆菌来源氨肽酶168AP的热稳定性，并实现其在工程菌株中的高效异源表达，以拓宽其应用范围。首先，利用在线预测软件预测可能提高168AP热稳定性的突变热点，并对经过初步筛选后热稳定性提升的2个氨肽酶突变体的酶学性质进行测定。随后，运用分子对接技术模拟氨肽酶及其突变体与底物的相互作用，并通过分子动力学模拟解析R39I热稳定性提升的机制。最后，在解淀粉芽孢杆菌中实现热稳定性提高的氨肽酶突变体的高效异源表达。最终成功筛选到2个热稳定性提高的氨肽酶突变体，其中，突变酶R39I在60 ℃处理30 min后残余酶活力是野生型的1.61倍；与此同时，分子对接结果显示R39I与底物的对接结合自由能在所有突变体中最低，为–4.93 kcal/mol；分子动力学模拟结果表明，氨肽酶突变前后引发的疏水作用力改变是其热稳定性提高的主要原因。解淀粉芽孢杆菌Δ6/pLY-3-R39I在7 L发酵罐发酵酶活力达到43 131.57 U/mL，是摇瓶发酵水平的5.11倍。本研究成功筛选得到热稳定性提高的氨肽酶突变体，并实现其在工程菌株中的高效异源表达，拓宽了氨肽酶的工业应用范围。

摘要:γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate acid, GABA)是一种非蛋白质氨基酸，作为新型功能性因子，在食品、医药、化工及农业等领域有着广泛的应用价值。谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)是生物法合成GABA的限速酶，具有良好热稳定性是实现其工业化应用的重要前提。为挖掘热稳定性好、催化活性高的GAD，降低GABA的制备成本，本研究以GABA工业生产菌株短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis) GAD氨基酸序列(LbGAD)为模板，利用FireProt^ASR系统获得其祖先酶蛋白序列，进一步通过“基因探矿”技术获得1个潜在的鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)源耐热型GAD (EgGAD)。酶学性质分析显示，EgGAD的最适反应温度和pH值分别为60 ℃和pH 5.0，米氏常数(K_m)为10.94 mmol/L，催化效率(k_cat/K_m)为2.07 L/(s∙mmol)，半失活温度(T₅₀¹⁵)为61.14 ℃，较LbGAD高4.94 ℃，在55 ℃条件下的半衰期(t_1/2)为105.04 min，约为LbGAD的5倍，表明EgGAD具有良好的催化活性和热稳定性。在此基础上，通过代谢工程手段于益生菌Escherichia coli Nissle 1917细胞中实现了EgGAD的可溶性表达，并研究了工程菌株催化合成食品级GABA的性能。结果显示，将诱导后的E. coli Nissle (T7)/pET28a-EggadB细胞加入至含有3 mol/L l-谷氨酸(l-Glu)的200 mL纯水中(OD₆₀₀为20)，在40 ℃、150 r/min且非控制pH条件下反应4 h后，GABA产量高达300.94 g/L，转化率超过99.5%。本研究通过祖先酶序列重构策略介导的基因探矿技术挖掘了1个新的耐热型GAD，为生物法合成GABA提供了一个良好的功能元件，也为其他酶稳定性的改造提供了一个可供借鉴的方法。

摘要:截短血红蛋白(truncated hemoglobin)是一种存在于细菌中的血红蛋白。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)来源的截短血红蛋白YjbI氨基酸序列与高等生物来源的YjbI存在差异。为了研究异源表达后YjbI的结构与性质，本研究以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)为宿主，将yjbI基因序列密码子优化后连接到表达载体pET-28a(+)上，成功进行表达，之后通过His亲和标签纯化得到较高纯度的YjbI。采用SDS-PAGE、圆二色光谱分析、血红素结合率测定和氧结合能力测定等方法对纯化后的截短血红蛋白进行了分析。发现在表达时间为26 h，2% 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)添加量的条件下产量最高，YjbI表达量由122.02 mg/L提升至133.19 mg/L。圆二色光谱分析、AlphaFold3结构预测分析发现，YjbI通过形成α-螺旋结构并折叠出血红素结合位点，最终构建出完整的蛋白质三维构象。经全波长扫描和比尔-朗伯定律计算得到，添加ALA前后YjbI的血红素结合率由13.18%提升到22.78%。利用氧化还原法对氧结合能力进行测定，表明YjbI具有较高的氧气亲和力。本研究成功实现了截短血红蛋白在大肠杆菌中的异源表达，系统分析了其结构与功能特性，为微生物血红蛋白的应用提供了理论和技术基础。

摘要:目前轴手性的生物催化合成面临一定挑战。为拓展轴手性化合物的生物合成方法，本研究进行了醇脱氢酶催化的含吡咯和吲哚基团的N−N轴手性醛的还原反应，通过对92种醇脱氢酶进行筛选得到2种立体选择性相反的菌株，利用动力学拆分以最高72%转化率、98% e.e.合成了具有良好选择性的R以及S构型产物。确定了N−N轴的绝对构型以及旋转能垒，并通过量级合成和衍生化实验展示了当前方法的实用性。本研究首次提供了具有潜在药用价值的N−N轴手性化合物的酶促合成策略，为酶催化轴手性化合物的合成奠定了良好基础。

摘要:大曲是中国传统白酒生产中的关键糖化发酵剂，研究大曲糖化酶及其协同应用对酿酒工业的现代化升级具有重要意义。然而，单纯针对大曲体系开展酶资源挖掘，面临着目标范围广泛、工作量大、适用性不足等挑战。基于此，本研究通过对白酒发酵过程的宏蛋白质组及宏基因组数据进行解析，筛选出17种优势淀粉糖化酶蛋白并依据其基因序列设计引物，成功从大曲中克隆出细菌、真菌和昆虫来源的8种淀粉糖化酶基因。本研究成功表达了象牙色克罗彭施泰特氏菌(Kroppenstedtia eburnea)来源的α-1,4-葡萄糖苷酶KeGA5及微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)来源的α-淀粉酶RpAM11，其中KeGA5为K. eburnea功能酶异源表达的首次报道。KeGA5和RpAM11的最适反应温度分别为55 ℃和75 ℃，最适pH分别为5.0和7.0–8.0，且在50 ℃以下和pH 5.0–8.0范围内表现出较好的稳定性。白酒发酵过程中的温度和乙醇浓度对酶活性影响显著，但对稳定性影响较小；发酵产生的酸性环境对酶活性和稳定性均有较大影响。此外，KeGA5和RpAM11在水解多种含有α-1,4-葡萄糖苷键的底物时表现出协同作用，尤其对可溶性淀粉和糊精显示出最高水解活性。高粱底物孵育实验表明，重组酶组合在释放麦芽糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸方面的效果与大曲粗酶体系相似。本研究提出了大曲糖化酶理性挖掘及功能特性研究的新策略，为未来白酒工业中功能酶制剂和菌酶混合制剂的开发提供了科学参考。

摘要:肠道微生物参与的色氨酸代谢能够产生多种吲哚衍生物促进人体健康。乳酸杆菌作为有益的肠道细菌，部分菌株已经被开发成为重要的益生菌，但大多数菌株的色氨酸代谢能力仍不明晰。本研究旨在利用基因组学方法，通过分析特定功能基因揭示乳酸杆菌色氨酸代谢潜在能力，使快速筛选具备生成特定色氨酸代谢产物能力的菌株成为可能。基于新构建的色氨酸代谢功能基因数据集，分析了从公共数据库下载的我国《可用于食品的菌种名单》中16种2 235株乳酸杆菌基因组序列，结果显示除广布乳杆菌属外，乳酸杆菌菌株具有丰富的色氨酸代谢基因，尤其是吲哚-3乳酸生成相关代谢酶基因，超过92%的菌株具有芳香族氨基酸氨基转移酶(aromatic amino acid aminotransferase, ArAT)、吲哚乳酸脱氢酶(indolelactate dehydrogenase, FLDH)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)，拷贝数分别为1−11个、1−7个和1−11个，表现出了较高的吲哚-3-乳酸生成潜力。系统发育分析研究了吲哚-3-乳酸生成相关代谢酶ArAT、FLDH和LDH的相似性，结果显示ArAT、FLDH和LDH可以分别聚为3−4个簇，每簇的序列都来自不同菌种的菌株，表明乳酸杆菌的吲哚-3-乳酸生成潜力还受到基因型的影响。本研究通过新构建的色氨酸代谢基因数据集，分析了色氨酸代谢基因尤其是吲哚-3-乳酸代谢基因在乳酸杆菌菌株中的分布和基因的系统发育分析，深入解析了乳酸杆菌色氨酸代谢特征，为利用基因组学方法开发功能菌株提供了理论基础和筛选方法。

摘要:肉毒神经毒素(botulinum neurotoxins, BoNTs)是一种神经毒性蛋白质，可水解参与突触囊泡融合的可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide factor attachment protein receptor, SNARE)。其中，囊泡相关膜蛋白(synaptobrevin-2, Sb2)是BoNTs主要靶向的SNARE蛋白之一。本研究旨在开发一种基于酵母的BoNTs检测系统，用于分析靶向Sb-2的BoNTs。鉴于SNARE蛋白在真核生物中的高度保守性，Snc1和Snc2是酿酒酵母中Sb-2的同源物，本研究构建了功能性的SNARE嵌合蛋白，其中Snc2中的SNARE结构域的一部分被Sb-2的相应区域所取代，从而Snc2/Sb2-4嵌合蛋白可以被BoNTs所识别。由于Snc1和Snc2是酵母产孢所必需的，因此在携带Snc2/Sb2-4嵌合蛋白的snc1∆snc2∆酵母中，靶向Sb-2蛋白的BoNTs (包括BoNT/B在内)表达后显著降低了孢子的形成效率。然而，在野生型酵母中，BoNTs表达的影响可以忽略不计。产孢效率在本研究中被用作检验BoNTs活性的指标。这种方法的优点在于可以通过荧光比色法来评估酵母的产孢效率，进而反映出BoNTs的活性。最终，本研究基于酵母细胞构建的体系不仅能够简单便捷地分析BoNTs，还能够用于挖掘未鉴定的BoNTs和BoNTs抑制剂。鉴于BoNTs广泛应用于临床和美容领域，该体系有望为发现和优化具有应用价值的BoNTs提供有力支持。

摘要:双组分系统是一种广泛存在于细菌中的信号传递系统，能够有效地发挥信号识别、信号传导、基因调节这3种功能，从而实现信号的跨膜传输和放大。基于双组分系统构建的基因表达调控工具已被广泛应用于合成生物学和环境监测领域。传统基因诱导系统T7和P_BAD系统存在成本高、诱导剂易被细胞利用、诱导剂浓度与基因表达水平线性差等问题。为了开发低成本、诱导剂浓度与基因表达水平线性高的诱导系统，本研究基于双组分系统CusS-CusR和嵌合NrsS/CusS-CusR，成功开发了分别由Cu²⁺和Ni²⁺诱导的基因表达系统。通过优化组氨酸激酶(CusS或NrsS/CusS)与响应调节蛋白(CusR)的表达水平，将Cu²⁺诱导表达系统本底表达荧光强度由2 400 a.u.降低至852 a.u.，动态范围由1.2倍提升至8.7倍。同样结构的Ni²⁺诱导表达系统本底荧光强度为2 711 a.u.，动态范围为5.6倍。进一步通过提升目标基因的核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)强度和报告质粒拷贝数，使Cu²⁺诱导系统和Ni²⁺诱导系统的动态范围分别提升至50.0倍和14.3倍。与传统T7和P_BAD诱导系统相比，本研究构建的Cu²⁺和Ni²⁺诱导系统表现出更优的诱导梯度和更低的诱导成本，不仅为传统表达系统提供了有力补充，也为满足多样化实验需求提供了更多选择。

摘要:丙酮酸是一种重要的有机酸，在食品、化工和医药等领域广泛应用。酶法合成丙酮酸存在酶活性低的问题，严重制约着丙酮酸的工业化生产。低通量的筛选方法是筛选高活性酶突变体的瓶颈，生物传感器能够为酶的分子改造提供高通量的筛选方法。本研究以大肠杆菌的转录因子PdhR为研究对象，构建响应丙酮酸的生物传感器。首先，将PdhR的结合位点插入3个启动子的不同位置构建杂合启动子并验证其响应活性，结果表明杂合启动子P_tacD、P_ticM和P_trpD具有较好的响应活性。其次，通过优化PdhR表达量改善生物传感器的响应性能，其中生物传感器B2-1能灵敏地响应丙酮酸的浓度变化，具有较宽的配体检测范围(0–12 g/L丙酮酸)，其荧光响应倍数为14。最后，生物传感器B2-1的配体特异性分析表明生物传感器B2-1仅响应丙酮酸，对其他酮酸不敏感，具有较强的配体特异性。因此，本研究构建的响应丙酮酸的生物传感器可用于高活性酶突变体的高通量筛选，为酶和菌种的分子改造提供了高效、灵敏的筛选工具，进一步为丙酮酸的工业化生产奠定了基础。

摘要:本研究旨在开发一种低成本、便携式且绝对定量的数字核酸检测芯片，以解决现有数字核酸检测方法成本高、样本损失、操作复杂和对设备依赖性强等问题。为此，进行了一种创新的芯片设计：通过流体通道与真空通道的解耦和分离，采用分形结构设计流体通道，实现了样本的高效自动分配和100%的样本利用率；同时，设计的真空通道有效解决了分形结构芯片在预脱气和负压维持方面的难题，无需预先进行耗时的脱气操作，使检测可随时进行。此外，基于黑色聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)材料开发的数字重组酶聚合酶扩增(digital recombinase polymerase amplification, dRPA)芯片，展现出优异的光学成像能力和强大的抗背景荧光干扰能力，为光学检测提供了理想平台。本研究还提出了一种新的防蒸发策略，通过水溶液包围每个微室防止试剂蒸发，进一步优化了检测性能。最终，本研究成功开发出一种便携式的dRPA核酸检测解决方案，仅需简单的手动操作和智能手机即可完成检测。该方案不仅保留了简单、低成本、可扩展性和绝对定量的优势，还显著提高了检测的便捷性和实用性，为便携式核酸检测的广泛应用奠定了基础。这种创新的检测方案有望在资源有限的环境中实现快速、准确的核酸检测，推动现场快速诊断技术的发展。

摘要:合成生物学旨在通过构建人工生物系统来理解生命和设计生命，是新一轮科技革命和产业变革的新引擎。为了适应合成生物学前沿知识与传统生物科学框架的融汇交叉，本文聚焦于全新设置的“合成生物学”课程中元件开发与设计基础知识的教学现状，提出理论传授与Foldit实践操作有机结合的方式，增强学生对“蛋白质元件折叠与设计”的掌握与运用。从课程设计、教学方法等方面进行探讨，提出智能软件辅助解决课程难点的策略。创新的教学模式有效促进了学生在蛋白质设计前沿领域的创新能力与实践技能的发展，对于培养适应未来科技挑战的生物科学人才具有重要意义。

摘要:随着全球化改革浪潮的不断推进以及科学技术的迅猛发展，工程教育国际化已成为推动高等教育改革的重要途径。本文立足中外合作办学专业，以天津科技大学生物工程学院中英合作办学项目(生物工程专业-酿造与蒸馏)为例，探讨当前工程教育国际化形势下中外合作办学领域所存在的问题及解决办法。通过创新国际化人才培养理念、强化国际化师资水平、优化国际化课程体系、实施多元化教学模式、建立持续监管改进机制的“五元融合”改革，构建符合国际工程教育认证标准和国际市场需求的人才培养体系，培养具有家国情怀及全球视野的国际化卓越工程人才。本文期望为其他高校中外合作办学项目提供实践参考，助力其在工程教育国际化进程中培养出更多高素质人才。

摘要:学科交叉课程的设置和教学是培养实践能力和创新能力强、具备国际竞争力的高素质复合型新工科人才的有效手段之一。然而目前基于多学科简单堆叠式的教学思路难以取得有效而满意的教学效果。为此，立足于江南大学优势学科生物工程与纺织工程的发展和交叉融合，对跨学科课程“纺织生物技术”的教学方式进行改革和创新。构建“交互式”教学模式，重组多维度“融会式”教学内容，建立“循环上升式”教学质量控制体系，优化以评价学生的“跨学科思维和创新能力”为目标的考核体系，调整师资队伍“学缘结构”。最后从课程建设、学生能力提升和教师队伍建设等方面总结了所获得的实践教学成果，为提高学科交叉课程的教学效果提供了有益的借鉴和参考。

摘要:当代我国的高等工程教育范式已经迈入了从重知识基础、重能力培养阶段向重素质塑造阶段的蜕变之路。如何在新工科的快速发展建设背景下，培养出既具备扎实专业知识，又富有创新精神和实践能力的工科人才已成为各类工程专业教育面临的核心议题和亟待破解的难题。本文以生物工程专业课程体系中的一门主干课程“基因工程”为例，阐释了实施问题导向学习(problem-based learning, PBL)模式，线上线下混合教学的改革思路。实践证明，这种思路不仅显著提升了课程的教学质量和学生的学习成效，更为培养具有创新精神、实践能力和正确价值观念的工科人才提供了可借鉴的模式。

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