山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达

摘要:

以质粒pKF3为模板，扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因的DNA片段，连至pMD18T载体，构建得到pMD18PC。以质粒pQE60SDH为模板，扩增山梨糖脱氢酶基因sdh，与pMD18PC连接，得到pMD18PCSDH。将其用PvuⅡ酶切，回收含ptsG1catsdhptsG2的目的片段，电转化至JM109/pKD46，在Red重组酶的作用下，外源DNA片段与染色体上对应区域发生同源重组，将基因ptsG敲除，替换为catsdh基因，获得整合sdh基因的JM109s。经检测JM109s具有山梨糖脱氢酶活性。以 ptsG基因上下游序列为引物，JM109s基因组DNA为模板进行PCR，扩增产物测序结果表明sdh基因染色体整合成功。

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